Sau khi cuộc Bắc phạt bắt đầu, ông trở thành người tuyên truyền tầng lớp lao động. Năm 1926, ông tổ chức một cuộc tổng đình công tại Thượng Hải, mở ngỏ thành phố cho Quốc Dân Đảng. Khi liên minh Quốc-Cộng tan vỡ, Chu Ân Lai phải bỏ trốn trước cuộc khủng bố trắng. Cuối cùng ông tới vùng căn cứ Giang Tây và dần chuyển từ hệ tư tưởng chính thống đô thị sang nhánh Mao ủng hộ cách mạng nông thôn bên trong Đảng Cộng sản Trung Quốc, và trở thành một thành viên nổi bật của Đảng. Sự chuyển biến này đã hoàn thành ngay từ đầu cuộc Vạn lý Trường chinh, khi vào tháng 1 năm 1935 Chu Ân Lai hoàn toàn ủng hộ Mao trong cuộc đấu tranh với nhóm 28 người bolshevik.

Những năm tại Diên An, Chu Ân Lai là người tích cực ủng hộ một mặt trận thống nhất chống Nhật Bản. Vì thế ông đóng vai trò quan trọng trong sự biến Tây An, giúp Tưởng Giới Thạch được thả, và đàm phán Mặt trận Thống nhất Quốc-Cộng thứ hai, và đưa ra câu nói nổi tiếng "Người Trung Quốc không nên đánh nhau với người Trung Quốc mà với một kẻ thù chung: quân xâm lược". Trong Chiến tranh Trung-Nhật (1937-1945) Chu Ân Lai đóng vai trò đại sứ trong chính phủ thời chiến của Tưởng Giới Thạch ở Trùng Khánh và tham gia vào những cuộc đàm phán thất bại sau Thế chiến II.